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bet9注册:常识分享:卵白质含量的测定技巧

  卵白质含量测定法,是生物化学探究中最常用、最基础的解析方式之一。目前常用的有四种陈腐的经典方式,即定氮法、双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫表汲取法。此表再有一种近十年才集体利用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。个中Bradford法和Lowry法精巧度最高,比紫表汲取法精巧10~20倍,比Biuret法精巧100倍以上。定氮法固然对照庞大,但较精确,往往以定氮法测定的卵白质动作其他方式的圭表卵白质。

  值得注视的是,这后四种方式并不行正在职何条款下合用于任何格式的卵白质,由于一种卵白质溶液用这四种方式测定,有能够得出四种分其余结果。每种测定法都不是完整完好的,都有其优偏差。正在抉择方式时应试虑:①实行对测定所恳求的精巧度和正确度;②卵白质的本质;③溶液中存正在的作对物质;④测定所要花费的工夫。考马斯亮蓝法(Bradford法),因为其出色的长处,正获得越来越广大的操纵。

  样品与浓硫酸共热。含氮有机物即阐明爆发氨(消化),氨又与硫酸效用,酿成硫酸氨。经强碱碱化使之阐明放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,依照此酸液被中和的水准可盘算推算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其响应式如下:

  为了加快消化,能够插足CuSO4作催化剂,K2SO4以普及溶液的沸点。收罗氨可用硼酸溶液,滴定章用强酸。实行和盘算推算方式这里从略。

  盘算推算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中卵白含量,应将总氮量减去非卵白氮即得。如欲进一步求得样品中卵白质的含量,即用样品中卵白氮乘以6.25即得。

  双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃支配加热,放出一个分子氨后获得的产品。正在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4变成紫色络合物,称为双缩脲响应。凡拥有两个酰胺基或两个直接相连的肽键,或能过一个中央碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲响应。

  紫色络合物色彩的深浅与卵白质浓度成正比,而与卵白质分子量及氨基酸因素无合,故可用来测定卵白质含量。测定局限为1-10mg卵白质。作对这一测定的物质重要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

  此法的长处是较疾捷,分其余卵白质爆发色彩的深浅附近,以及作对物质少。重要的偏差是精巧度差。于是双缩脲法常用于须要疾捷,但并不须要相等正确的卵白质测定。

  (1)圭表卵白质溶液:用圭表的结晶牛血清清卵白(BSA)或圭表酪卵白,配造成10mg/ml的圭表卵白溶液,可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有须要,圭表卵白质还可预先用微量凯氏定氮法测定卵白氮含量,盘算推算出其纯度,再依照其纯度,称量配造成圭表卵白质溶液。牛血清清卵白用H2O 或0.9%NaCl配造,酪卵白用0.05NNaOH配造。

  (2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4·5H2O)和6.0克酒石酸钾钠

  (KNaC4H4O6·4H2O),用500毫升水熔化,正在搅拌下插足300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,储存于塑料瓶中(或内壁涂以白腊的瓶中)。此试剂可永久留存。若储存瓶中有玄色浸淀崭露,则须要从新配造。

  1. 圭表弧线支试管分两组,差别插足0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的圭表卵白质溶液,用水补足到1毫升,然后插足4毫升双缩脲试剂。充实摇匀后,正在室温(20-25℃)下安顿30分钟,于540nm处举行比色测定。用未加卵白质溶液的第一支试管动作空缺比较液。取两组测定的均匀值,以卵白质的含量为横座标,光汲取值为纵座标绘造圭表弧线个试管,用上述同样的方式,测定未知样品的卵白质浓度。注视样品浓度不要抢先10mg/ml。

  这种卵白质测定法是最精巧的方式之一。过去此法是操纵最广大的一种方式,因为其试剂乙的配造较为繁难(现正在已能够订购),近年来慢慢被考马斯亮兰法所庖代。此法的显色道理与双缩脲方式是一致的,只是插足了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以弥补显色量,从而普及了检测卵白质的精巧度。这两种显色响应爆发深兰色的因由是:

  正在碱性条款下,卵白质中的肽键与铜团结天生复合物。‚Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被卵白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,爆发深兰色(钼兰和钨兰的同化物)。正在必然的条款。

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